反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用*泛的技術(shù)，主要是因為它適用于分析絕大多數的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。
如果污染是因為重復進(jìn)樣時(shí)強保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡(jiǎn)單的清洗步驟來(lái)除去這些污染物往往就能恢復其色譜性能。經(jīng)過(guò)等度運行后的高效液相色譜柱，有時(shí)用90～100%含量的溶劑B(雙溶劑反相系統中洗脫能力較強的溶劑，如甲醇、乙晴、四氫 呋喃等)沖洗20個(gè)柱體積可以清除污染物(色譜柱的柱體積和空柱管體積概念不同，一根4.6x250mm柱子的柱體積只有2.5ml，2.1x150mm的是0.28ml)。
如果使用的是緩沖鹽系統，不要直接切換到強溶劑，突然轉換到高濃度有機溶劑可能會(huì )使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖鹽沉淀，這樣會(huì )導致更大的問(wèn)題，如柱頭篩板堵塞、連接管路堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉軸失靈。應該先用無(wú)緩沖鹽流動(dòng)相(即把緩沖液換成水)，沖洗5～10個(gè)柱體積以后才切換到用強溶劑清洗。
有時(shí)候，強溶劑B也沒(méi)法把殘留在高效液相色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要用更強的溶劑或者是系列溶劑組合。
如果污染物不是生物質(zhì)的，一種強溶劑或幾種溶劑組合清洗基本能解決問(wèn)題。柱子生產(chǎn)廠(chǎng)家的網(wǎng)頁(yè)和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上很多也有清洗方法推薦。
所有的清洗方法的模式普遍都類(lèi)似，溶劑系列中所用溶劑的強度逐級增加，最后一個(gè)溶劑往往是非極性(疏水性)很強的(如醋酸乙酯甚至是烷烴)，以便于溶解脂質(zhì)、油類(lèi)等非極性污染物。溶劑系列中每個(gè)溶劑都保證能與下一個(gè)溶劑互溶。
整個(gè)清洗過(guò)程結束后，在回到原來(lái)的流動(dòng)相體系前，必須借助一個(gè)中等強度的互溶性非常好的溶劑過(guò)渡。例如， 異丙醇是一個(gè)非常好的過(guò)渡溶劑，它既能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過(guò)高。
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